Rytp wiki: Недопустимое название — YTP вики

При добавлении возрастающих концентраций SsbA к dT ₅₀ в отсутствие Mg ²⁺ образовался единый комплекс с подвижностью геля ниже, чем у несвязанного dT ₅₀ (комплекс A ₁ ) .Весь dT ₅₀ был преобразован в этот комплекс при концентрации SsbA, которая соответствовала приблизительно одному тетрамеру SsbA на молекулу dT ₅₀ , и не было никаких указаний на образование второго комплекса при более высоких концентрациях SsbA (рис. дополнительные данные не показаны). Аналогичный образец связывания был получен с более длинным олигомером, dT ₆₅ (гель не показан). Эти результаты показали, что один SsbA способен связываться с dT ₅₀ и dT ₆₅ в этих условиях реакции.

Когда длина олигомера была увеличена до dT ₇₅ , с увеличением концентрации SsbA образовался комплекс A ₁ , аналогично тому, как это наблюдается с более короткими олигомерами. Однако при дальнейшем увеличении концентрации SsbA комплекс A ₁ исчез и образовался новый комплекс с еще более низкой подвижностью геля (комплекс A ₂ ). Этот результат показал, что второй SsbA был способен связываться с dT ₇₅ в этих условиях.Аналогичный образец связывания наблюдался с более длинными олигомерами, dT ₈₅ , dT ₉₀ и dT ₁₀₀ , что указывает на то, что два SsbA также были способны связываться с каждым из этих олигомеров (Рисунок 2).

Когда длина олигомера была увеличена до dT ₁₃₀ , комплексы A ₁ и A ₂ образовывались с увеличением концентрации SsbA аналогично тому, как это наблюдалось с dT ₁₀₀ . Однако при более высоких концентрациях SsbA образовывался третий комплекс с более низкой подвижностью, чем комплексы A ₁ и A ₂ (комплекс A ₃ ).Этот результат показал, что три SsbA были способны связываться с dT _{, 130,} в этих условиях (рис. 2).

Результаты на рисунке 2 показали, что самый короткий олигомер dT _n в наборе, который был способен связывать два SsbA в отсутствие Mg ²⁺ , был dT ₇₅ , а самый короткий олигомер dT _n , способный связывать три SsbA, был dT ₁₃₀ . Эти результаты приведены в таблице 1.

Наличие магния

При добавлении возрастающих концентраций SsbA к dT ₅₀ в присутствии Mg ²⁺ образовался единый комплекс с подвижностью геля ниже, чем у несвязанного dT ₅₀ (комплекс A ₁ ) , без указания на образование второго комплекса при более высоких концентрациях SsbA (рис. 3). Аналогичный образец связывания был получен с dT ₆₅ (гель не показан). Эти результаты были аналогичны тем, которые были получены в отсутствие Mg ²⁺ , и показали, что один SsbA был способен связываться с dT ₅₀ и dT ₆₅ в присутствии Mg ²⁺ .Комплексы ₁ также образовывались при добавлении возрастающих концентраций SsbA к более длинным олигомерам, dT ₇₅ и dT ₈₅ , но в отличие от результатов, которые были получены в отсутствие Mg ²⁺ , A ₂ комплексов не были обнаружены с этими олигомерами (рис. 3).

Когда длина олигомера была увеличена до dT ₉₀ , при более низких концентрациях SsbA образовался комплекс A ₁ , аналогично тому, как это наблюдается с более короткими олигомерами.Однако при дальнейшем увеличении концентрации SsbA комплекс A ₁ исчез и образовался новый комплекс с еще более низкой подвижностью геля (комплекс A ₂ ). Этот результат показал, что второй SsbA был способен связываться с dT ₉₀ в этих условиях. Аналогичный образец связывания был получен с dT ₁₀₀ и dT ₁₃₀ , что указывает на то, что два SsbA также способны связываться с каждым из этих олигомеров. Однако в отличие от результатов, которые были получены в отсутствие Mg ²⁺ , не было никаких указаний на образование третьего комплекса с dT ₁₃₀ , даже при самых высоких концентрациях SsbA, которые были исследованы (Рисунок 3 ).

Результаты на Фигуре 3 показали, что самый короткий олигомер dT _n в наборе, который был способен связывать два SsbA в присутствии Mg ²⁺ , был dT ₉₀ , и что только два SsbA были способны связывать связываются даже при увеличении длины олигомера до dT ₁₃₀ . Эти результаты приведены в таблице 1.

Сборка белка SsbB

Комплексы, которые были образованы белком SsbB с различными олигомерами dT _n в отсутствие и в присутствии Mg ²⁺ , показаны на рисунках 4 и 5, соответственно ( примечание : в этих экспериментах разделение свободных олигомеров dT _n и различных комплексов SsbB · dT _n меньше, чем наблюдаемое с белком SsbA, из-за меньшего размера молекулы белка SsbB и повышенной электрофоретической подвижности СсбБ · дТ _н комплексов).

Фигура 4. Связывание белка SsbB с олигомерами dT _n в отсутствие Mg ²⁺ .

Реакционные растворы содержали 25 мМ трис ацетата (pH 7,5), 5 мкМ dT _n (концентрация нуклеотидов) и указанные концентрации белка SsbB (концентрации тетрамера). Реакции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием гелевого рабочего буфера, состоящего из трис ацетата (pH 7,5). Полосы, соответствующие несвязанным олигомерам dT _n и комплексам B ₁ и B ₂ , визуализировали с помощью фосфорного изображения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g004

Рисунок 5. Связывание белка SsbB с олигомерами dT _n в присутствии Mg ²⁺ .

Реакционные растворы содержали 25 мМ трис ацетата (pH 7,5), 10 мМ ацетата магния, 5 мкМ dT _n (концентрация нуклеотидов) и указанные концентрации белка SsbB (концентрации тетрамера). Реакции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием гелевого рабочего буфера, состоящего из трис ацетата (pH 7.5) и 10 мМ ацетата магния. Полосы, соответствующие несвязанным олигомерам dT _n и комплексам B ₁ и B ₂ , визуализировали с помощью фосфорного изображения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g005

Отсутствие магния

При добавлении возрастающих концентраций SsbB к dT ₅₀ в отсутствие Mg ²⁺ образовался единый комплекс с подвижностью геля ниже, чем у несвязанного dT ₅₀ (комплекс B ₁ ) .Весь dT ₅₀ был преобразован в этот комплекс при концентрации SsbB, которая соответствовала приблизительно одному тетрамеру SsbB на молекулу dT ₅₀ , и не было никаких указаний на образование второго комплекса при более высоких концентрациях SsbB (рис. дополнительные данные не показаны). Аналогичный образец связывания был получен с более длинными олигомерами, dT ₆₅ (гель не показан) и dT ₇₅ (Фиг.4). Эти результаты показали, что только один SsbB способен связываться с этими олигомерами в этих условиях.

Когда длина олигомера была увеличена до dT ₈₅ , при более низких концентрациях SsbB образовался комплекс B ₁ , аналогично тому, как это наблюдается с более короткими олигомерами. Однако при дальнейшем увеличении концентрации SsbB комплекс B ₁ исчез и образовался новый комплекс с еще более низкой подвижностью геля (комплекс B ₂ ). Этот результат показал, что второй SsbB был способен связываться с dT ₈₅ в этих условиях (фигура 4).Аналогичный образец связывания наблюдали с более длинными олигомерами, dT ₉₀ , dT ₁₀₀ и dT ₁₃₀ , что указывает на то, что два SsbB также способны связываться с каждым из этих олигомеров. Однако не было никаких указаний на образование третьего комплекса с этими олигомерами даже при самых высоких концентрациях SsbB, которые были исследованы (рис. 4).

Результаты на Фигуре 4 показали, что самый короткий олигомер dT _n в наборе, который был способен связывать два SsbB в отсутствие Mg ²⁺ , был dT ₈₅ , и что только два SsbB были способны связывать связываются даже при увеличении длины олигомера до dT ₁₃₀ .Эти результаты приведены в таблице 1.

Наличие магния

При добавлении возрастающих концентраций SsbB к dT ₅₀ в присутствии Mg ²⁺ образовался единый комплекс с подвижностью геля ниже, чем у несвязанного dT ₅₀ (комплекс B ₁ ) , без указания на образование второго комплекса при более высоких концентрациях SsbB (рис. 5). Аналогичный образец связывания был получен с более длинными олигомерами, dT ₆₅ (гель не показан) и dT ₇₅ (Фиг.5).Эти результаты были аналогичны тем, которые были получены в отсутствие Mg ²⁺ , и показали, что только один SsbB был способен связываться с этими олигомерами в этих условиях. Комплексы B ₁ также образовывались при добавлении возрастающих концентраций SsbB к более длинным олигомерам, dT ₈₅ и dT ₉₀ , но в отличие от результатов, которые были получены в отсутствие Mg ²⁺ , B ₂ комплексов не были обнаружены с этими олигомерами (рис. 5).

Когда длина олигомера была увеличена до dT ₁₀₀ , при более низких концентрациях SsbB образовался комплекс B ₁ , аналогично тому, как это наблюдается с более короткими олигомерами. Однако при дальнейшем увеличении концентрации SsbB комплекс B ₁ исчез и образовался новый комплекс с еще более низкой подвижностью геля (комплекс B ₂ ). Этот результат показал, что второй SsbB был способен связываться с dT ₁₀₀ в этих условиях (Фиг.5).Аналогичный образец связывания был получен с dT ₁₃₀ , что указывает на то, что два SsbB также способны связываться с этим олигомером. Однако не было никаких указаний на образование третьего комплекса с этими олигомерами даже при самых высоких концентрациях SsbB, которые были исследованы (рис. 5).

Результаты на Фигуре 5 показали, что самый короткий олигомер dT _n в наборе, который был способен связывать два SsbB в присутствии Mg ²⁺ , был dT ₁₀₀ , и что только два SsbB были способны связывать связываются даже при увеличении длины олигомера до dT ₁₃₀ .Эти результаты приведены в таблице 1.

Совместная сборка белков SsbA и SsbB

Также была исследована способность белков SsbA и SsbB совместно собираться на олигомерах dT _n . Для этих экспериментов были выбраны олигомеры dT _n , которые были достаточно длинными, чтобы приспособиться к связыванию либо двух SsbAs, либо двух SsbB в различных условиях раствора (см. Таблицу 1).

Отсутствие магния

Первая серия экспериментов по совместной сборке в отсутствие Mg ²⁺ была проведена с dT ₉₀ (рис. 6).Когда избыточная концентрация только SsbA была добавлена ​​к dT ₉₀ , образовался комплекс A ₂ с двумя SsbA, связанными с dT ₉₀ . Аналогично, когда избыточная концентрация одного SsbB была добавлена ​​к dT ₉₀ , образовался комплекс B ₂ с двумя SsbB, связанными с dT ₉₀ . Однако, когда SsbA и SsbB были добавлены вместе к dT ₉₀ , снова образовались комплексы A ₂ и B ₂ , но почти не было смешанных комплексов с одним SsbA и одним SsbB, связанными с одним и тем же dT ₉₀ . молекулы (о чем судили по отсутствию новой полосы с подвижностью, промежуточной между подвижностью комплексов A ₂ и B ₂ ).Эти результаты показали, что хотя либо два SsbA, либо два SsbB могли связываться с dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ , связывание одного SsbA и одного SsbB с dT ₉₀ было неблагоприятным в этих условиях.

Фигура 6. Связывание белков SsbA и SsbB с dT ₉₀ и dT ₁₀₀ в отсутствие Mg ²⁺ .

Реакционные растворы содержали 25 мМ трис ацетата (pH 7,5), 5 мкМ dT ₉₀ ( слева, ) или dT ₁₀₀ ( справа, ) (общая концентрация нуклеотидов) и указанные концентрации SsbA и SsbB. белок (концентрации тетрамера). A, Реакции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием гелевого буфера, состоящего из трис ацетата (pH 7,5). Полосы, соответствующие несвязанным олигомерам dT _n и комплексам A ₂ , B ₂ и A · B, были визуализированы с помощью фосфорного изображения. B, Дорожки для реакций, которые содержали 0,15 мкМ SsbA, 0,15 мкМ SsbB и либо dT ₉₀ ( слева, ), либо dT ₁₀₀ ( справа, ), сканировали, чтобы показать относительную интенсивность полос для указанных комплексов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g006

Вторую серию экспериментов по совместной сборке проводили в отсутствие Mg ²⁺ с более длинным олигомером, dT ₁₀₀ (рис. 6). Когда к dT ₁₀₀ добавлялась избыточная концентрация либо SsbA, либо только SsbB, образовывались соответствующие комплексы A ₂ или B ₂ , как и в случае dT ₉₀ . Однако, в отличие от результатов, полученных с dT ₉₀ , комплексы A ₂ и B ₂ и третий комплекс с промежуточной подвижностью были образованы, когда SsbA и SsbB были добавлены вместе к dT ₁₀₀ .Промежуточную полосу вырезали из геля, анализировали электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле, и было обнаружено, что она содержит примерно равные количества белка SsbA и SsbB (гель не показан). Эти результаты показали, что промежуточная полоса соответствует смешанному комплексу, в котором один SsbA и один SsbB связаны с dT ₁₀₀ (комплекс A · B).

Результаты на Фигуре 6 показали, что, хотя одновременное связывание SsbA и SsbB с dT ₉₀ было неблагоприятным в отсутствие Mg ²⁺ , SsbA и SsbB были способны связываться вместе на dT ₁₀₀ в этих условиях.

Наличие магния

Первая серия экспериментов по совместной сборке в присутствии Mg ²⁺ (10 мМ) была проведена с dT ₁₀₀ (рис. 7). Когда избыточная концентрация либо SsbA, либо только SsbB добавлялась к dT ₁₀₀ , соответствующие комплексы A ₂ и B ₂ образовывались, как ожидалось. Однако, когда SsbA и SsbB были добавлены вместе к dT ₁₀₀ , снова образовались комплексы A ₂ и B ₂ , но не было смешанных комплексов с одним SsbA и одним SsbB, связанными с одной и той же молекулой dT ₁₀₀ . обнаружены (о чем судят по отсутствию новой полосы с промежуточной подвижностью между комплексами A ₂ и B ₂ ).Эти результаты показали, что хотя два SsbA или два SsbB могут связываться с dT ₁₀₀ в присутствии Mg ²⁺ , связывание одного SsbA и одного SsbB с dT ₁₀₀ было неблагоприятным в этих условиях.

Фигура 7. Связывание белков SsbA и SsbB с dT ₁₀₀ и dT ₁₃₀ в присутствии Mg ²⁺ .

Реакционные растворы содержали 25 мМ трис-ацетата (pH 7,5), 10 мМ ацетата магния, 5 мкМ dT ₁₀₀ ( слева, ) или dT ₁₃₀ ( справа, ) (общая концентрация нуклеотидов) и указанные концентрации белка SsbA и SsbB (концентрации тетрамера). A, Реакции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием гелевого рабочего буфера, состоящего из трис ацетата (pH 7,5) и 10 мМ ацетата магния. Полосы, соответствующие несвязанным олигомерам dT _n и комплексам A ₂ , B ₂ и A · B, были визуализированы с помощью фосфорного изображения. B, Дорожки для реакций, которые содержали 0,15 мкМ SsbA, 0,15 мкМ SsbB и либо dT ₁₀₀ ( слева, ), либо dT ₁₃₀ ( справа, ), сканировали, чтобы показать относительную интенсивность полос для указанных комплексов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g007

Вторую серию экспериментов по совместной сборке проводили в присутствии Mg ²⁺ с более длинным олигомером, dT ₁₃₀ (рис. 7). Когда к dT ₁₃₀ добавлялась избыточная концентрация либо SsbA, либо только SsbB, образовывались соответствующие комплексы A ₂ или B ₂ , как и в случае dT ₁₀₀ . Однако, в отличие от результатов, полученных с dT ₁₀₀ , комплексы A ₂ и B ₂ , а также третий комплекс с промежуточной подвижностью были образованы, когда SsbA и SsbB были добавлены вместе к dT ₁₀₀ .Появление промежуточной полосы соответствовало образованию смешанного комплекса, в котором один SsbA и один SsbB были связаны с dT ₁₃₀ (комплекс A · B).

Результаты на Фигуре 7 показали, что, хотя одновременное связывание SsbA и SsbB с dT ₁₀₀ было неблагоприятным в присутствии Mg ²⁺ , SsbA и SsbB были способны связываться вместе на dT _{, 130,} в этих условиях.

Совместная сборка белка SsbA с белками SsbA / B и SsbB

Дополнительные эксперименты по совместной сборке были проведены с белком SsbA и двумя вариантами SSB: белком SsbA / B и белком SsbB ^RYTP .Белок SsbA / B представляет собой химерный белок, в котором С-концевой домен белка SsbA (аминокислоты 106–156) заменен на С-концевой домен белка SsbB (аминокислоты 105–131) [2]. . Белок SsbB ^RYTP представляет собой модифицированный белок SsbB, в котором последовательность из четырех аминокислот из N-концевого домена белка SsbB ( ¹⁸ HKTN ²¹ ) заменена соответствующей последовательностью из белка SsbA ( ¹⁸ RYTP ²¹ ) (Рисунок 1, Материалы и методы).Белок SsbA / B (15039 Да на мономер) и белок SsbB ^RYTP (14963 Да на мономер) аналогичны по размеру белку SsbB (14926 Да на мономер) и образуют комплексы на dT ₉₀ , которые четко видны. разрешается гель-электрофорезом из комплексов, образованных белком SsbA (17 350 Да на мономер). Эксперименты, аналогичные проведенным для белков SsbA и SsbB, показали, что либо два SsbA / Bs ((A / B) ₂ комплекс), либо два SsbB ^RYTP s (комплекс B ^RYTP ₂ ) были способны к связываются с dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ .

Белок SsbA / B.

Первоначальный набор экспериментов по совместной сборке SsbA и SsbA / B проводился с dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ (рис. 8). Когда избыточная концентрация либо SsbA, либо только SsbA / B добавлялась к dT ₉₀ , как и ожидалось, образовывались соответствующие комплексы A ₂ и (A / B) ₂ . Однако, когда SsbA и SsbA / B были добавлены вместе к dT ₉₀ , образовались комплексы A ₂ и (A / B) ₂ и третий комплекс с промежуточной подвижностью.Появление промежуточной полосы соответствовало образованию смешанного комплекса, в котором один SsbA и один SsbA / B были связаны с dT ₉₀ (комплекс A · A / B).

Рисунок 8. Связывание белков SsbA и SsbA / B с dT ₉₀ .

Реакционные растворы содержали 25 мМ трис ацетата (pH 7,5), 5 мкМ dT ₉₀ (общая концентрация нуклеотидов) и указанные концентрации белка SsbA и SsbA / B (концентрации тетрамера). A, Реакции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием гелевого буфера, состоящего из трис ацетата (pH 7.5). Полосы, соответствующие несвязанному олигомеру dT ₉₀ и комплексам A ₂ , (A / B) ₂ и A · A / B, визуализировали с помощью фосфорного изображения. B, Дорожку для реакции, которая содержала 0,15 мкМ SsbA и 0,10 мкМ SsbA / B, сканировали, чтобы показать относительные интенсивности полос для указанных комплексов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g008

Эти результаты показали, что, хотя одновременное связывание SsbA и SsbB было неблагоприятным (Рисунок 6), SsbA был способен образовывать смешанный комплекс с SsbA / B. на dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ (Фиг.8).Дополнительные эксперименты показали, что SsbA / B также отличается от SsbB тем, что он способен образовывать смешанный комплекс с SsbA на dT ₁₀₀ в присутствии Mg ²⁺ (гель не показан).

Белок SsbB

Первоначальный набор экспериментов по совместной сборке SsbA и SsbB ^RYTP также был проведен с dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ (рис. 9). Когда избыточная концентрация либо SsbA, либо только SsbB ^RYTP была добавлена ​​к dT ₉₀ , как и ожидалось, образовались соответствующие комплексы A ₂ и B ^RYTP ₂ .Однако, когда SsbA и SsbB ^RYTP были добавлены вместе к dT ₉₀ , образовались комплексы A ₂ и B ^RYTP ₂ и третий комплекс с промежуточной подвижностью. Появление промежуточной полосы соответствовало образованию смешанного комплекса, в котором один SsbA и один SsbB ^RYTP были связаны с dT ₉₀ (комплекс A · B ^RYTP ).

Фигура 9. Связывание белков SsbA и SsbB ^RYTP с dT ₉₀ .

Реакционные растворы содержали 25 мМ трис ацетата (pH 7,5), 5 мкМ dT ₉₀ (общая концентрация нуклеотидов) и указанные концентрации белка SsbA и SsbB ^RYTP (концентрации тетрамера). A, Реакции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием гелевого буфера, состоящего из трис ацетата (pH 7,5). Полосы, соответствующие несвязанному олигомеру dT ₉₀ и комплексам A ₂ , B ^RYTP ₂ и A • B ^RYTP , были визуализированы с помощью фосфорного изображения. B, Дорожку для реакции, которая содержала 0,15 мкМ SsbA и 0,15 мкМ SsbB ^RYTP , сканировали, чтобы показать относительные интенсивности полос для указанных комплексов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g009

Эти результаты показали, что, хотя одновременное связывание SsbA и SsbB было неблагоприятным (Рисунок 6), SsbA смог образовать смешанный комплекс с SsbB ^RYTP. на dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ (Фиг.9).Однако дополнительные эксперименты показали, что SsbB ^RYTP , как и SsbB, неспособен образовывать смешанный комплекс с SsbA на dT ₁₀₀ в присутствии Mg ²⁺ (гель не показан).

Обсуждение

Результаты, представленные здесь, показывают, что самый короткий олигомер dT _n , который способен приспосабливать связывание двух SsbA или двух SsbB, строго определен и зависит от того, включен ли Mg ²⁺ в реакцию. раствор (таблица 1).Это открытие предполагает, что минимальная длина олигомера может определяться предпочтительными способами связывания и потенциальной связывающей способностью отдельных белков SSB в конкретных условиях раствора.

Сборка белка SsbA

Самый короткий олигомер dT _n , который был способен связывать два SsbA в отсутствие Mg ²⁺ , был dT ₇₅ (таблица 1). Предполагая, что SsbA взаимодействует с олигомерами dT _n в качестве тетрамера в SSB ₃₅ -подобном режиме в отсутствие Mg ²⁺ (см. Введение), два SsbA могут собираться на dT ₇₅ в этих условиях. способом, которым каждый из SsbAs взаимодействует с ~ 35-нуклеотидным сегментом олигомера.Наблюдение, что только два SsbA были способны связываться даже при увеличении длины олигомера до dT ₁₀₀ , тогда как три SsbA были способны связываться с dT ₁₃₀ , указывает на то, что по крайней мере ∼35 нуклеотидный сегмент dT _n требовалось для стабильного связывания каждого SsbA (таблица 1). Во всех случаях по мере увеличения концентрации SsbA комплекс dT _n с меньшим количеством связанных SsbAs полностью заменялся комплексом с большим количеством связанных SsbAs.Эти результаты показывают, что в условиях режима связывания, подобного SSB ₃₅ , отдельные SsbA могут организовываться так, чтобы максимизировать количество SsbAs, связанных с олигомером dT _n , при удовлетворении потребности в связывании ∼35 нуклеотидов для каждого связанного SsbA.

Более длинный олигомер dT _n требовался для связывания двух SsbA, когда Mg ²⁺ был включен в реакционный раствор (таблица 1). Предполагая, что SsbA взаимодействует с олигомерами dT _n в качестве тетрамера в SSB ₆₅ -подобном режиме связывания в присутствии Mg ²⁺ (см. Введение), вероятно, что потребность в увеличенной длине связана с более высокая связывающая способность SsbA в этих условиях.Комплексы, содержащие два SsbAs, которые наблюдались с dT _{, 130,} , согласуются с SSB ₆₅ -подобным способом связывания в том, что dT ₁₃₀ является достаточно длинным, чтобы удовлетворить полную емкость ∼65 нуклеотидов, ожидаемую для каждого из связанных SsbAs (всего около 130 нуклеотидов) (рис. 10). Однако в этих условиях стабильные комплексы, содержащие два SsbAs, также могут образовываться на олигомерах длиной dT ₉₀ (Таблица 1). С этими более короткими олигомерами один или оба SsbA предположительно были связаны с использованием только части их потенциальной связывающей способности.Эти результаты предполагают, что в условиях режима связывания, подобного SSB ₆₅ , два SsbA способны собираться на более короткие сегменты одноцепочечной ДНК посредством скоординированного разделения цепи ДНК между связанными белками.

Рисунок 10. Независимые связывающие комплексы ДНК с общей цепью.

Первый комплекс представляет собой независимый связывающий комплекс , в котором каждый из двух тетрамеров SSB связан с 65-нуклеотидным сегментом молекулы dT ₁₃₀ .Второй комплекс представляет собой -связывающий с общей цепью комплекс , в котором один тетрамер SSB связан с 65-нуклеотидным сегментом, а второй тетрамер SSB связан с оставшимся 25-нуклеотидным сегментом молекулы dT ₉₀ ( неравное совместное использование ). Третий комплекс представляет собой связывающий с общей цепью комплекс , в котором каждый из двух тетрамеров SSB связан с 45-нуклеотидным сегментом молекулы dT ₉₀ ( с равным общим ). Пути, показанные для цепей dT _n в этих комплексах, являются предположительными и основаны на структурной модели белка SsbEc, связанного с одноцепочечной ДНК в режиме связывания SSB ₆₅ [7].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g010

Для нити ДНК можно предусмотреть различные схемы в механизме «связывания с общей нитью» (рис. 10). Например, с dT ₉₀ один SsbA может быть связан с сегментом из 65 нуклеотидов, а второй SsbA может быть связан с оставшимся сегментом из 25 нуклеотидов олигомера. Альтернативно, dT _{, 90,} может быть более равномерно распределен между двумя SsbA, при этом каждый из них связывается с сегментом из 45 нуклеотидов олигомера.Эти возможности не обязательно являются взаимоисключающими, и также может иметь место комбинация различных обязательных механизмов. В любом случае, наблюдение, что комплексы с двумя SsbA не образовывались на олигомерах dT _n короче, чем dT ₉₀ , когда Mg ²⁺ был включен в реакционный раствор, но могли образовываться на олигомерах такой длины, как dT ₇₅ в отсутствие Mg ²⁺ (таблица 1) предполагает, что расположение общих цепей, которое принимается, когда два SsbAs связываются в SSB ₆₅ -подобном режиме, может отличаться от расположения связывания, которое используется, когда два SsbA связываются в режиме, подобном SSB ₃₅ .

Сборка белка SsbB

Более длинные олигомеры dT _n требовались для связывания двух SsbB, чем были необходимы для двух SsbA, как в отсутствие, так и в присутствии Mg ²⁺ (Таблица 1). Предполагая, что SsbB взаимодействует с олигомерами dT _n в качестве тетрамера в SSB ₆₅ -подобном режиме в отсутствие Mg ²⁺ и в усиленном SSB ₆₅ -подобном режиме в присутствии Mg ²⁺ (см. Введение), требование большей длины может отражать более высокую связывающую способность SsbB по сравнению с SsbA в этих условиях реакции.Комплексы, содержащие два SsbB, которые наблюдались с dT ₁₃₀ как в отсутствие, так и в присутствии Mg ²⁺ , согласуются либо с SSB ₆₅ -подобным режимом, либо с усиленным SSB ₆₅ -подобным режимом связывания в что dT ₁₃₀ достаточно длинный, чтобы удовлетворить полную ∼65 нуклеотидную связывающую способность, ожидаемую для каждого из связанных SsbB в любом случае (всего ∼130 нуклеотидов) (Фиг.10). Однако стабильные комплексы, содержащие два SsbB, также могут образовываться на таких коротких олигомерах, как dT ₈₅ (в отсутствие Mg ²⁺ ) или dT ₁₀₀ (в присутствии Mg ²⁺ ).Эти результаты предполагают, что два SsbB могут связываться с более короткими олигомерами с использованием механизма связывания с общей цепью, аналогичного предложенному для SsbA в присутствии Mg ²⁺ (условия режима связывания, подобные SSB ₆₅ ) (Фиг.10). В случае SsbB наблюдение, что dT ₈₅ способно приспособиться к связыванию двух SsbB в отсутствие Mg ²⁺ , тогда как по крайней мере dT ₁₀₀ требовалось для связывания двух SsbB в присутствии Mg ²⁺ может отражать разницу в расположении общей цепи между двумя SsbB в нормальных условиях связывания в режиме, подобном SSB ₆₅ , по сравнению с усиленным режимом связывания, подобным SSB ₆₅ .

Совместная сборка белков SsbA и SsbB

Самый короткий олигомер dT _n , который был способен поддерживать одновременное связывание одного SsbA и одного SsbB, также был строго определен и зависел от условий раствора.

В отсутствие Mg ²⁺ комплексы, содержащие либо два SsbAs, либо два SsbB, легко образовывались на dT ₉₀ . Однако при добавлении обоих белков к dT ₉₀ было обнаружено небольшое количество смешанных комплексов с одним SsbA и одним SsbB или вовсе их не было (фигура 6).Если предположить, что связывающая способность SsbA в этих условиях составляет ~ 35 нуклеотидов (SSB ₃₅ -подобный режим), а связывающая способность SsbB принимается равной ~ 65 нуклеотидов (SSB ₆₅ -подобный режим), то dT ₉₀ молекулы не будет достаточно длинной, чтобы удовлетворить полную связывающую способность одного SsbA и одного SsbB (всего ~ 100 нуклеотидов). Следовательно, одновременное связывание SsbA и SsbB с dT ₉₀ предположительно потребовало бы связывания одного или обоих этих белков с использованием только части их потенциальной связывающей способности.Отсутствие образования смешанного комплекса на dT ₉₀ , таким образом, предполагает, что SsbA и SsbB не способны участвовать в связывании с общей цепью в отсутствие Mg ²⁺ .

Очевидная несовместимость в связывании с общей цепью, по-видимому, не препятствует независимому связыванию SsbA и SsbB с более длинными олигомерами dT _n , где совместное использование цепей не требуется. Хотя они были неспособны совместно собираться на dT ₉₀ , SsbA и SsbB были способны образовывать смешанный комплекс на dT ₁₀₀ в отсутствие Mg ²⁺ (Фиг.6).В этом случае молекула dT ₁₀₀ может потенциально обеспечивать ∼35-нуклеотидный сегмент для SsbA и ∼65-нуклеотидный сегмент для SsbB, и тем самым удовлетворять полную связывающую способность обоих белков в условиях реакции.

также, по-видимому, регулирует совместную сборку SsbA и SsbB на олигомерах dT _n , когда Mg ²⁺ включен в реакционный раствор. Хотя комплексы с двумя SsbA или двумя SsbB легко образовывались либо на dT ₁₀₀ , либо на dT ₁₃₀ в присутствии Mg ²⁺ , смешанные комплексы с одним SsbA и одним SsbB были обнаружены только с dT ₁₃₀ (рис. 7).Если предполагается, что связывающая способность SsbA в этих условиях составляет ~ 65 нуклеотидов (SSB ₆₅ -подобный режим), а связывающая способность SsbB также предполагается ~ 65 нуклеотидов (усиленный SSB ₆₅ -подобный режим), Молекула dT _{, 130,} могла бы удовлетворить полную связывающую способность одного SsbA и одного SsbB (всего ∼130 нуклеотидов), тогда как молекула dT ₁₀₀ могла бы только частично удовлетворить связывающую способность двух белков. Таким образом, образование смешанных комплексов на dT ₁₃₀ , но не на dT ₁₀₀ , указывает на то, что SsbA и SsbB способны связываться независимо, но не могут участвовать в связывании с общей цепью в присутствии Mg ^{. 2+} .

SsbA / B и SsbB

Хотя SsbA и SsbB оказались несовместимыми для связывания с общей цепью, SsbA был способен образовывать смешанные комплексы в некоторых условиях связывания с общей цепью с двумя вариантами белка SSB: белком SsbA / B и белком SsbB ^RYTP .

Белок SsbA / B, в котором С-концевой домен белка SsbA заменен С-концевым доменом из белка SsbB, был приготовлен ранее для оценки вклада С-концевых доменов в свойства связывания ДНК. белков SsbA и SsbB [2].Было обнаружено, что предпочтения режима связывания ДНК белка SsbA / B аналогичны таковым у белка SsbA, предполагая, что первичные структурные детерминанты связывания ДНК могут содержаться в N-концевых доменах различных белков SSB [2]. Более того, белок SsbA / B был способен образовывать смешанный комплекс с SsbA на dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ и на dT ₁₀₀ в присутствии Mg ²⁺ (Фиг. гель не показан). Эти данные предполагают, что неспособность SsbA участвовать в связывании общей цепи с SsbB не может быть связана с несходным C-концевым доменом белка SsbB, поскольку C-концевой домен белка SsbA / B идентичен таковому. белка SsbB.Однако возможно, что C-концевой домен функционирует иначе в белке SsbB, чем в химерном белке SsbA / B, и вносит вклад в несовместимость SsbA и SsbB в связывании с общей цепью.

Белок SsbB ^RYTP , в котором последовательность ¹⁸ HKTN ²¹ белка SsbB заменена соответствующей последовательностью ¹⁸ RYTP ²¹ из белка SsbA, также был приготовлен в попытке определить структурная основа дифференциальных свойств связывания ДНК белков SsbA и SsbB.Было обнаружено, что ДНК-связывающие свойства белка SsbB ^RYTP аналогичны свойствам белка SsbB, что указывает на то, что последовательность ¹⁸ HKTP ²¹ может не отвечать за характерные предпочтения режима связывания ДНК белка SsbB ( см. Экспериментальные процедуры). Однако белок SsbB ^RYTP отличался от белка SsbB тем, что он был способен образовывать смешанный комплекс с SsbA на dT ₉₀ в отсутствие Mg ²⁺ (Фиг.9).Эти результаты предполагают, что несовместимость связывания с общей цепью, которая наблюдалась с белками SsbA и SsbB в отсутствие Mg ²⁺ , не была связана с различием в их предпочтительных способах связывания ДНК, а может быть отнесена к разнице ¹⁸ RYTP ²¹ и ¹⁸ HKTN ²¹ последовательности этих белков. Однако наблюдение, что SsbB ^RYTP не смог образовать смешанный комплекс с SsbA на dT ₁₀₀ в присутствии Mg ²⁺ , указывает на то, что этой разницы в последовательностях недостаточно для учета несовместимости связывания с общей цепью. это наблюдалось с SsbA и SsbB в присутствии Mg ²⁺ .Таким образом, введение последовательности ¹⁸ RYTP ²¹ в белок SsbB имеет эффект разъединения Mg ²⁺ -независимой несовместимости связывания с общей цепью от Mg ²⁺ -зависимой несовместимости.

Последовательность ¹⁸ RYTP ²¹ белка SsbA, по крайней мере, частично консервативна в белке SsbEc и в ряде других гомотетрамерных бактериальных белков SSB, чьи кристаллические структуры рентгеновских лучей были определены (фигура 11).Анализ различных структур показывает, что третичные складки N-концевых доменов во всех случаях схожи и что последовательность ¹⁸ RYTP ²¹ белка SsbA и дивергентная последовательность ¹⁸ HKTN ²¹ белка SsbB, соответствуют области Loop 1 на внешней поверхности субъединиц тетрамеров SSB (Рисунок 11) [6] — [7]. Различия в составе области петли 1 могут объяснять неспособность белков SsbA и SsbB участвовать в связывании с общей цепью в отсутствие Mg ²⁺ .Например, вариации петли 1 могут предположительно влиять на точную ориентацию цепи ДНК, когда она наматывается вокруг отдельных тетрамеров SSB, или влиять на способ взаимодействия двух тетрамеров SSB, когда они связаны в непосредственной близости на цепи ДНК. Однако, по-видимому, необходимы другие молекулярные детерминанты для совместимости связывания с общей цепью в присутствии Mg ²⁺ . Окончательное определение молекулярной основы связывания с общей цепью и совместимости связывания ДНК потребует дальнейшего структурного анализа различных комплексов SSB-dT _n .Эти исследования в настоящее время ведутся в нашей лаборатории.

Рисунок 11. Петля 1 области бактериальных белков SSB.

A, Сравнение последовательностей из области Loop 1 белков SSB из Escherichia coli (код PDB 1eyg), Mycobacterium tuberculosis (код PDB 1ue1), Mycobacterium smegmatis (код PDB 1x3e), Helicobacter pylori (код PDB 2vw9) и Streptomyces coelicolor (код PDB 3eiv) с соответствующими последовательностями из белков SsbA и SsbB Streptococcus pneumoniae, . B, Структурная модель комплекса тетрамер SsbEc ( зеленый ) — одноцепочечная ДНК ( синий ) (на основе кода PDB 1eyg) [7]. Последовательность RYMP в области Loop 1 каждой субъединицы SsbEc выделена ( красный ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024305.g011

Совместимость привязки SsbA и SsbB

SsbA является конститутивно экспрессируемым белком и предположительно функционирует как первичный белок SSB во время рутинной репликации и поддержания хромосомной ДНК в S.pneumoniae (аналог белка SsbEc в E. coli ). SsbB, напротив, индуцируется специфически во время естественной трансформации и временно связывается с одноцепочечной формой экзогенной ДНК до того, как ДНК будет включена в гомологичный участок хромосомы S. pneumoniae (аналог SsbB отсутствует. белок в E.coli ) [1], [8].

Степень, в которой белки SsbA и SsbB функционально взаимозаменяемы в этих различных активностях, не ясна.Наши результаты, однако, показывают, что белки SsbA и SsbB будут способны связываться вместе на более длинных одноцепочечных сегментах ДНК, где возможно независимое связывание, но предполагают, что они не могут совместно собираться на более коротких одноцепочечных сегментах ДНК, где согласованные взаимодействия между соседними SSB не требуется. Требование совместимости для связывания с общей цепью может предположительно служить механизмом самопознания, который регулирует способ взаимодействия SsbA и SsbB в S.пневмония .

Материалы и методы

Материалы

S. pneumoniae Белок SsbA [9], белок SsbB [10] и белок SsbA / B [2] получали, как описано ранее. Очищенные гелем олигомеры dT _n были от Invitrogen. ³² Меченный на Р-конце dT _n олигомеров получали с использованием [γ- ³² P] АТФ (PerkinElmer) и полинуклеотидкиназы Т4 (New England Biolabs).

Получение и характеристика белка SsbB

Кодирующая последовательность белка SsbB ^RYTP , в которой была сгенерирована нуклеотидная последовательность белка SsbB, соответствующая аминокислотам ¹⁸ HKTN ²¹ , на последовательность, кодирующую аминокислоты ¹⁸ RYTP ²¹ . мутагенезом ПЦР с расширением перекрывания.Исходной матрицей мутагенеза была описанная нами ранее конструкция pETssbB, которая содержит последовательность SsbB дикого типа, клонированную в сайт NdeI / HindIII вектора экспрессии pET21a (Novagen) [10]. Праймер a (5′-CGGATAACAATTCCCCTCTAG-3 ‘) и праймер d (5′-TTAGCAGCCGGATCTCAGTGG-3′) фланкировали ген ssbB , а праймер b (5’TAGTAGTCATTGGGAGTG) c (5′-GAATTGCGTTACACTCCAAATGACAAGTCGGTAGC-3 ‘) были внутренними перекрывающимися мутагенными праймерами (мутагенные основания подчеркнуты).Конечный продукт ПЦР, кодирующий SsbB ^RYTP , расщепляли с помощью NdeI и HindIII и затем клонировали в сайт NdeI / HindIII вектора экспрессии pET21a с получением конструкции pETssbB ^RYTP . Вставку секвенировали и обнаружили, что она идентична ожидаемой кодирующей последовательности белка SsbB ^RYTP .

Экспрессионная плазмида pETssbB ^RYTP была введена в E.coli штамм Rosetta (DE3) pLysS (Novagen), и белок SsbB ^RYTP был очищен из полученных клеток Rosetta (DE3) pLysS / pETssbB ^{RYTP RYTP RYTP RYTP RYTP RYTP RYTP RYTP RYTP. процедура аналогична описанной ранее для белка SsbB дикого типа [10].Конечная фракция белка SsbB RYTP имела чистоту более 95% по данным электрофореза в SDS-полиакриламидном геле.}

Очищенный белок SsbB ^RYTP охарактеризовали с использованием анализа связывания dT ₃₅ , который был описан ранее для белков SsbA и SsbB [2]. Результаты были аналогичны тем, которые были получены с белком SsbB дикого типа, и показали, что белок SsbB ^RYTP был способен связывать две молекулы dT ₃₅ в отсутствие Mg ²⁺ и два dT ₃₅ молекул (с положительной межсубъединичной кооперативностью) в присутствии 10 мМ Mg ²⁺ .

Анализ для электрофореза в полиакриламидном геле

Растворы реакции связывания dT _n (30 мкл) содержали 25 мМ трис ацетата (pH 7,5), 5% глицерина, 1 мМ дитиотреитола и концентрации ацетата магния, dT _n ( ³² P-конец, меченный), и белок SSB, указанный в подписях к рисункам. Реакционные растворы инкубировали при 25 ° C в течение 15 минут, а затем добавляли 3 мкл раствора для загрузки геля (0,25% бромфенолового синего, 40% сахарозы).Аликвоту (20 мкл) конечного раствора анализировали электрофорезом на 5% природных полиакриламидных гелях с использованием буферной системы, состоящей из 25 мМ трис ацетата (pH 7,5) и той же концентрации ацетата магния, что и в реакционных растворах. Полосы, соответствующие несвязанным и связанным с SSB олигомерам dT _n , визуализировали с использованием имидж-сканера Fuji FLA-7000. Конкретные концентрации белка для отдельных гелей на рисунках 2–9 были выбраны, чтобы проиллюстрировать зависящее от концентрации образование различных комплексов SSB-dT _n .

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: FRB BS. Проведены эксперименты: БС ГА. Проанализированы данные: ФРБ БС. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: FRB BS GA. Написал статью: FRB BS.

Ссылки

1. 1. Клаверис Дж. П., Мартин Б., Полард П. (2009) Механизм генетической трансформации: состав, локализация и механизм. FEMS Microbiol Rev 33: 643–656.
2. 2. Grove DE, Bryant FR (2006) Влияние Mg ²⁺ на способы связывания ДНК белков SsbA и SsbB Streptococcus pneumonia .J Biol Chem 281: 2087–2094.
3. 3. Grove DE, Willcox S, Griffith JD, Bryant FR (2005) Дифференциальные свойства связывания одноцепочечной ДНК паралогичных белков SsbA и SsbB из Streptococcus pneumoniae . J Biol Chem 280: 11067–11073.
4. 4. Шереда Р.Д., Козлов А.Г., Лохман Т.М., Кокс М.М., Кек Дж.Л. (2008) SSB как организатор / мобилизатор комплексов поддержания генома. Crit Rev Biochem Mol Biol 43: 289–318.
5. 5. Lohman TM, Ferrari ME (1994) Escherichia coli одноцепочечный ДНК-связывающий белок: множественные способы связывания ДНК и взаимодействия.Анну Рев Биохим 63: 527–570.
6. 6. Сайкришнан К., Манджунатх Г.П., Сингх П., Джеякантан Дж., Даутер З. и др. (2005) Структура Mycobacterium smegmatis одноцепочечного ДНК-связывающего белка и сравнительное исследование с участием гомологичных SSB: биологические последствия структурной пластичности и изменчивости четвертичной ассоциации. Acta Crystallographica D61: 1140–1148.
7. 7. Рагхунатан С., Козлов А.Г., Лохман Т.М., Ваксман Г. (2000) Структура ДНК-связывающего домена E.coli SSB, связанный с оцДНК. Nat Struct Biol 7: 648–652.
8. 8. Morrison DA, Mortier-Barriere I, Attaiech L, Claverys JP (2007) Идентификация основного белкового компонента комплекса пневмококкового затмения. J Bacteriol 189: 6497–6500.
9. 9. Steffen, SE, Bryant FR (2001) Очистка и характеристика одноцепочечного ДНК-связывающего белка из Streptococcus pneumoniae . Arch Biochem Biophys 388: 165–170.
10. 10.Hedayati MA, Grove DE, Steffen SE, Bryant FR (2005) Экспрессия и очистка белка SsbB из Streptococcus pneumoniae . Protein Expr Purif 43: 133–139.

Папа Свинья Прикол — Novocom.top

Свинка Пеппа возвращается в кинотеатры, чтобы отпраздновать свое 15-летие

Мы любим свинка Пеппа Пеппа едет в Париж # 33 YouTube

Мем свинка пеппа свинка пеппа, De peppa, Caricaturas

MLG Peppa Pig Peppa’s Air Horn! YouTube

Gif-анимации свиньи Пеппы ~ Gifmania

свинья папа пеппа жир баннер

свинья папа плачет грустно почему

папа свинья

свинья папа пеппа мем рост вес возраст перси вики биография высокий био анимированный дошкольное телевидение британский персонаж сериал dreshare

свинья папа пеппа связанный

папа свинья

свинья пеппа, папа, беги, малышка, оставайся на канале, малыш

папа свинья

свинья папа право

свинья папа рост вес возраст мем био вики мемулос ноги

папа убивает мемы папа убивает мемы очень вики memesmonkey ebaumsworld

свинья папа ванна кровать спит booktrust

свинья пеппа папа официальный канал лицо бит праздник картина vaderdag lovekid

свинья папа глупый

свинья пеппа папа мультфильм мультики биты эпизоды дети

свинья папа свиньи пеппа папа верхом на лошадях ричард персонажи пеппапиг день рождения вики персонаж импримир пара папа отец разорвал артисты твари мумия

рубашка daddy pig business teepublic

папа свинья

свинья пеппа папа мем

свинья пеппа обои папа мумия джордж аниме в руках 1080 mlg винтовки очки с компьютерным фоном wallpaperplay

свинья папа пеппа знакомьтесь nickjr правда

свинья пеппа мем папа мумия мемы папа порно мама шаблон кулиандо ритп шаблон

свинья пеппа жир эпизоды английский

свинья пеппа папа бегает автобус исправляет канал официальный свиньи lovekid

свинья пеппа vsco папа смешные мемы стикеры хомяк обои george phone computer cartoon cakoti

свинья пеппа папа джордж аниме мумия куриная хижина 1080 обои 1920 разрешение 1280

свинья папа бекон рисунок людвиг ван бдсм рисунки распечатывает 17 декабря загружено

свинья пеппа испорченные мемы детство мем темный смешной секрет пенис член пенис папа свиньи pepe random knowyourmeme reddit redd mildlypenis

свинья пеппа мем обои мемы рисовать пещера спросил брат

свинья пеппа папа беги забава пингвин книги свиньи божья коровка

свинья пеппа мистер паук забанен

свинка пеппа отредактировал эпизод другое развлечение

мемов папы-свиньи — Новоком.верх

мем бегущий свинья 90е папа

папа мемы пеппа

свинья мем папа

мем свинка пеппа папа мем смотрит

свинья мемы

свинья пеппа жирный папа непослушный издевательства глупо говорю я учу детей глаз телевизор

свинья папа пеппа мем рост возраст вес перси вики биография высокий био анимированный телевидение дошкольное учреждение британский персонаж сериал dreshare

свинья пеппа мемы папа отредактировал эпизод

пеппа толстый папа зовет свинью мем imgflip живот

свинья пеппа папа мем

свинья папа мем imgflip caption

мемы свинья пеппа мемы папа триггер армия зоопарк